طراحی و ایجاد جهش های نقطه ای در ژن آلفا آمیلاز سوش bacillus amyloliquefaciens به منظور افزایش پایداری حرارتی و ارزیابی ویژگی های ساختاری و سینتیکی این جهش یافته ها

?- آمیلاز bacillus licheniformis (bla)، به عنوان همتای ترموفیل ?- آمیلازbacillus amyloliquefaciens (baa)، مدلی مناسب برای طراحی جهش های پایدار کننده در baa است. bla، علی رغم 80 درصد یکسانی در توالی اسید آمینه ای، ده باقیمانده هیستیدین بیش از baa دارد. با توجه به این تفاوت برجسته، در تحقیق حاضر سه مورد از این موقعیت ها در baa (i34، q67 و p407) با هیستیدین جایگزین شدند. نتایج نشان داد که پایداری حرارتی جهش یافته های p407h و q67h افزایش یافته است، اما تغییرات معناداری در پارامترهای سینتیکی آنها نسبت به آنزیم وحشی مشاهده نشد. جهش i34h باعث از دست رفتن کامل فعالیت آنزیمی شد. این نتایج با نتایج حاصل از مطالعات دورنگ نمایی دورانی، فلورسانس و ترمودینامیک سازگاری نشان دادند. با توجه به اینکه جهش p407h نیمه عمر baa در c? 75 را تقریباً یک ساعت افزایش داد، به کمک مطالعات جهش زایی بیشتر، نقش هیستیدین در این جایگاه را مورد بررسی قرار دادیم. مدل ساختاری baa در محل جهش p407h نشان داد که جایگزینی p407 با هیستیدین باعث قرارگیری دو هیستیدین در مجاورت یکدیگر می شود. جهت بررسی نقش هیستیدین در این جایگاه، p407 بطور جداگانه با چهار نوع اسید آمینه دیگر (ala، glu، arg و gln) جایگزین شد. بعلاوه جهت بررسی جفت شدگی هیستیدین-هیستیدین، دو جهش همزمان (p407h/h406a و p407h/h406n) نیز ایجاد گردید. نتایج نشان داد که سایر جایگزینی ها در این جایگاه اثر معناداری بر ویژگی های آنزیمی نداشت، به استثنای جهش p407r که منجر به بهبود جزئی پایداری حرارتی شد. این امر نشان می دهد که حضور یک اسید آمینه کاتیونی در جایگاه 407 اثر مثبتی بر پایداری حرارتی دارد. پایداری حرارتی جهش یافته های دوگانه نیز در مقایسه با جهش یافته p407h بطور معناداری کاهش یافت. علاوه بر این، پایداری حرارتی جهش یافته p407h در غیاب کلسیم در مقایسه با سایر انواع آنزیم افزایش یافت. نتایج ما به روشنی نشان داد که جفت هیستیدین 406 و 407 (و نه یک هیستیدین به تنهایی) عامل بهبود پایداری حرارتی جهش یافته p407h می باشد.